По мере того, как пандемия COVID-19 шла своим чередом, вопросы, которые мы задавали себе, эволюционировали: от «Как я узнаю, инфицирован ли я?» на «Насколько силен мой иммунитет?» на «Какой у меня штамм вируса?» И поскольку новые варианты продолжают появляться, вполне вероятно, что мы будем продолжать задавать себе эти вопросы, часто в одно и то же время.
Теперь есть способ получить ответы на все вопросы за пару часов без необходимости отправлять образцы в лабораторию. Новое диагностическое устройство для оказания медицинской помощи, созданное сотрудниками Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете, объединяет технологии Института eRapid и SHERLOCK в единую систему размером с открытку, которая может одновременно обнаруживать присутствие обоих вирусов SARS-CoV- 2 РНК и антитела против вируса в слюне пациента и, возможно, несколько других биомаркеров.
«Эта диагностика может обеспечить более дешевый мультиплексный мониторинг инфекции и иммунитета в популяциях с течением времени с уровнями точности, сравнимыми с дорогостоящими лабораторными тестами», — сказала соавтор Девора Наджар, аспирант MIT Media Lab и Wyss. институт. «Такой подход может значительно улучшить глобальный ответ на будущие пандемии, а также дать представление о том, какое лечение должны получать люди».
Прототип устройства описан в новой статье, опубликованной в журнале Nature Biomedical Engineering .
Новая химия для нового вируса
Диагностика родилась в результате сотрудничества между лабораториями членов основного факультета Wyss Джима Коллинза, доктора философии, и Дона Ингбера, доктора медицины, доктора философии, который также является директором-основателем Института. Команда eRapid во главе с Ингбером и старшим научным сотрудником Wyss Паваном Джолли, доктором философии, вместе с командой SHERLOCK во главе с Коллинзом и Хеленой де Пуч, доктором философии, постдокторским научным сотрудником Wyss, признали, что, хотя диагностика на основе SHERLOCK может обнаруживать молекулы с исключительной чувствительностью, они были изначально ограничены их системой считывания на основе флуоресценции. Если бы они могли найти способ преобразовать молекулярное обнаружение системы на основе CRISPR, такой как SHERLOCK, в электрохимический сигнал, подобный тому, который генерирует eRapid, они могли бы создать диагностику с точностью лабораторного уровня, которую можно было бы использовать вне лаборатории. . Они начали создавать это гибридное устройство и выбрали болезнь Лайма в качестве целевого приложения. За несколько месяцев они заработали.
Затем разразилась пандемия COVID-19.
«В первые дни все работали над разработкой средств диагностики, которые могли бы обнаруживать либо вирус SARS-CoV-2, либо антитела к нему, но не то и другое одновременно. Мы знали, что можем успешно обнаруживать присутствие молекул ДНК и РНК электрохимическим путем, благодаря нашей работы по болезни Лайма. Мы решили выяснить, как мультиплексировать это с обнаружением антител, чтобы создать универсальный тест, который поможет отслеживать инфекции и бороться с пандемией», — сказал де Пуч, соавтор исследования. бумага.
Но создание платформы, которая могла бы интегрировать обнаружение вирусной РНК и белков человека, было сложной задачей. Команде нужно было выяснить, как проводить два отдельных и очень разных типа молекулярных реакций одновременно, а затем интегрировать их в одну систему отчетности, чтобы результаты можно было считывать одновременно.
В качестве образца они выбрали слюну, потому что там могут быть обнаружены как вирусные частицы, так и антитела. Для той части диагностики SHERLOCK, которая выявляет присутствие РНК SARS-CoV-2, устройство должно было извлекать, концентрировать и амплифицировать вирусную РНК из образца слюны, затем смешивать ее с реагентами CRISPR и доставлять полученный результат. решение части чипа eRapid для обнаружения.
Команда разработала микрожидкостную систему, состоящую из нескольких резервуаров, каналов и нагревательных элементов, для автоматического смешивания и переноса веществ внутри прототипа устройства без участия пользователя. В первой камере слюна соединяется с ферментом, который разрывает внешнюю оболочку любого вируса, обнажая его РНК. Затем образец перекачивается в реакционную камеру, где он нагревается и смешивается с реагентами для изотермической амплификации с помощью петли (LAMP), которые амплифицируют вирусную РНК. Через 30 минут амплификации в камеру добавляют смесь, содержащую реагенты SHERLOCK, а затем образец перекачивают на электрод eRapid.
При отсутствии генетического материала SARS-CoV-2 в смеси одноцепочечные (оцДНК) молекулы с присоединенным к ним биотином связываются с молекулой, называемой пептидной нуклеиновой кислотой (ПНК), на поверхности электрода. Затем биотин связывается с другой молекулой в смеси, называемой поли-HRP-стрептавидин, что вызывает осаждение третьей молекулы, тетраметилбензидина (ТМБ) из жидкого раствора в виде твердого вещества. Когда твердый ТМБ попадает на электрод, его электропроводность меняется. Это изменение определяется как разница в силе электрического тока, протекающего через электрод, что указывает на отсутствие вируса в образце.
Однако, если в образце слюны присутствует какой-либо генетический материал SARS-CoV-2, фермент CRISPR в смеси SHERLOCK разрезает его, а также одноцепочечную ДНК. Это разрезающее действие отделяет молекулу биотина от одноцепочечной ДНК, так что, когда одноцепочечная ДНК связывается с ПНК, она не запускает ряд реакций, вызывающих осаждение ТМБ на электроде. Следовательно, проводимость электрода не изменилась, что свидетельствует о положительном результате теста.
«Интеграция анализа на основе ПНК с химией реакции поли-HRP-стрептавидин/ТМБ, которую мы создали для этого устройства, позволила нам обнаружить присутствие SARS-CoV-2 с в четыре раза большей чувствительностью, чем наш оригинальный SHERLOCK на основе флуоресценции. технологии и дал результаты примерно за то же время», — сказал соавтор Джошуа Рейнбоу, доктор философии, бывший приглашенный аспирант Института Висса, который сейчас учится в докторантуре Университета Бата. «Он также смог определить присутствие вирусной РНК со 100% точностью».
Больше, чем сумма его частей
Параллельно команда настроила оставшиеся три электрода eRapid, нанеся на них различные антигены, связанные с COVID, против которых у пациентов могут вырабатываться антитела: субъединица S1 шиповидного белка (S1), рибосомно-связывающий домен внутри этой субъединицы (S1-RBD). , и белок N, присутствующий в большинстве коронавирусов (N). Если образец слюны пациента содержит одно или несколько из этих антител, они связываются со своими антигенами-партнерами на электродах. Вторичное антитело, присоединенное к биотину, затем связывается с антителом-мишенью, вызывая ту же реакцию поли-HRP-стрептавидин/ТМБ и вызывая изменение проводимости электрода.
Исследователи протестировали эти специфические для антител датчики, используя образцы человеческой плазмы от пациентов, которые ранее дали положительный результат на SARS-CoV-2. Система смогла различать антитела против S1, S1-RBD и N с точностью более 95%.
«Возможность легко различать разные типы антител чрезвычайно полезна для определения того, обусловлен ли иммунитет пациентов вакцинами или инфекциями, и отслеживания силы этих различных уровней иммунитета с течением времени», — сказал Санджай Шарма Тимилсина, доктор философии, бывший научный сотрудник Института Висса, который сейчас является ведущим научным сотрудником StataDX . «Интеграция этого с обнаружением вирусной РНК в портативную мультиплексную диагностическую платформу обеспечивает всестороннее представление о здоровье пациента как во время, так и после инфекции, что необходимо для реализации государственной политики и стратегий вакцинации». StataDX коммерциализирует eRapid для неврологических, сердечно-сосудистых и почечных исследований.
