Слава технологий расширения тканей заключается в том, что, когда структуры, такие как белки, которые строят соединения нервных клеток, слишком малы для микроскопа, умная химия может сделать все больше и легче увидеть. Но иногда задействованные химические связи образуются именно там, где флуоресцентные метки антител должны прикрепляться к белкам, чтобы сделать их видимыми. Теперь группа исследователей Массачусетского технологического института решила эту проблему, продемонстрировав значительные улучшения в визуализации структуры нейронных связей с помощью стандартных конфокальных микроскопов.
Обновление реализовано в «eMAP», новой и улучшенной версии «увеличенного анализа протеома» или MAP, технологии, представленной в 2016 году лабораторией доцента Квангуна Чанга. «Е» означает сохранение эпитопа, что означает, что сайты связывания флуоресцентных меток антител блокируются с гораздо меньшей вероятностью. В недавней статье в журнале Science Advances Чанг и соавторы показывают, что с помощью eMAP многие белки в нейронных связях или « синапсах » теперь могут быть отображены, чего раньше не было.
«eMAP сохраняет мелкомасштабную молекулярную архитектуру синапсов и может способствовать высокопроизводительному анализу макромолекулярных ансамблей благодаря своей исключительной совместимости с большой библиотекой готовых антител», — сообщают ученые, в том числе ведущие авторы Джоха Парк. Сарим Кхан и Дэ Хи Юн. Они работают с Чангом в его лабораториях, охватывающих Институт обучения и памяти Пикауэра, Институт медицинской инженерии и науки и факультеты химической инженерии и мозга и когнитивных наук (BCS) Массачусетского технологического института.
Экспонирование эпитопов
Технологии расширения тканей работают путем введения акриламидной сетки в ткани для закрепления всех белков, чтобы при расширении сетки все они расширялись вместе с ней, но оставались в одном и том же месте относительно друг друга. Технологии обычно обеспечивают это закрепление химическими связями фиксирующего формальдегида. Ключевым достижением команды с eMAP была перенастройка метода, чтобы отказаться от этих химических связей в пользу настолько тонкого плетения сетки с большим количеством акриламида, что белки просто физически запутались бы с ней. Это сделало драгоценные эпитопы на белках более открытыми для связывания флуоресцентными метками антител.
«Одно из сделанных нами открытий заключается в том, что компоненты гидрогеля не нужно было вводить на этапе перфузии, когда присутствовал формальдегид, как это было в первоначальной реализации MAP, для достижения надежного расширения ткани», — сказал Юн.
Далее Парк пояснил: «Удаляя формальдегид перед добавлением раствора MAP, мы могли бы предотвратить химическую поперечную связь между белками и гидрогелевой сеткой; мы могли бы найти оптимальные условия, которые могли бы навсегда закрепить биомолекулы, позволяя антителам диффундировать очень глубоко внутрь ткани. ."
В ходе тестирования они обнаружили, что среди синаптических белков 49 из 51 метки антител теперь могут прикрепляться к eMAP, тогда как только 35 могут прикрепляться к MAP.
Используя eMAP, исследователи пометили белковые компоненты как на пресинаптической стороне (фагот), так и на постсинаптической стороне (PSD-95) возбуждающего синапса у мыши. Предоставлено: Chung Lab/MIT Picower Institute.
Видение синапсов
Чтобы изучить нейронаучную ценность этих новых возможностей маркировки в расширенной ткани, команда объединила усилия с двумя лабораториями BCS, которые изучают различные синапсы млекопитающих — лабораториями Элли Недиви, Уильяма Р. (1964) и Линды Р. Янг, профессора неврологии, и Гопин Фэн, Джеймс В. (1963) и Патрисия Т. Пойтрас, профессор.
Сотрудничество дало яркие изображения, без необходимости какого-либо усиления, ранее исключенных белков, таких как Bassoon и Piccolo, или тех, которые почти не появлялись раньше, таких как Homer1. Изображения ясно показали, как именно белки были расположены в синапсах, что позволило измерить их относительное расстояние друг от друга, а также их относительное количество.
eMAP также позволяла создавать многомасштабные изображения синапсов вдоль целых ветвей нейронов или дендритов, а это означало, что исследователям было легко не только заглянуть внутрь каждого метафорического дома синапса, но и увеличить масштаб до всей окрестности всей клетки. По словам Недиви, это большой прогресс для исследователей, потому что для изучения того, как синапсы изменяются глубоко в мозгу живых животных, используются приборы с более низким разрешением, изображения которых обычно должны проверяться методами с более высоким разрешением. Традиционно это делалось с помощью электронных микроскопов.
