CD4+ Т-клетки являются важными частями иммунной системы и играют ключевую роль в защите организма от патогенов. Поскольку они обладают большим разнообразием механизмов защиты от ВИЧ в состоянии покоя, они заражаются очень редко, но эти несколько инфицированных клеток образуют скрытый резервуар ВИЧ в организме, до которого в настоящее время не могут добраться противовирусные препараты. Следовательно, вирус может снова распространиться оттуда после активации CD4+ Т-клеток. Понимание того, как ВИЧ взаимодействует с покоящимися CD4+ Т-клетками, необходимо для поиска новых терапевтических подходов. Ученые во главе с профессором Оливером Т. Кеплером из Института Макса фон Петтенкофера в LMU разработали метод, который впервые позволяет эффективно и несложно генетически манипулировать этими специфическими иммунными клетками в физиологических условиях.Методы природы позволяют получить ранее недостижимое представление о биологии этих клеток.
Отдыхающие CD4+ Т- клеткивряд ли поддавались генетическим манипуляциям, потому что доступные методы обычно предполагают делящиеся клетки, как объясняет Кеплер. «А покоящиеся клетки не делятся по определению». В качестве первого шага в разработке нового метода команда ученых оптимизировала условия культивирования. В результате исследователи смогли сохранить эти клетки живыми в лаборатории после извлечения их из крови здоровых доноров не только в течение 3-4 дней, как раньше, а до шести недель. Решающий прогресс пришел с развитием нуклеофекции — специального метода, позволяющего доставлять реагенты в ядро клетки. Используя эту технику, исследователи внедрили генетические ножницы CRISPR-Cas в покоящиеся CD4+ Т-клетки, что позволило им вносить целенаправленные модификации в геном клеток-хозяев, например,генов с помощью так называемых нокаутов. «Эта комбинация работала очень эффективно, и мы смогли достичь и генетически манипулировать примерно 98 процентами клеток. Более того, мы сделали это без активации CD4+ Т-клеток», — говорит Кепплер. «Что особенно порадовало, так это то, что нам удалось с высокой эффективностью элиминировать до шести генов одновременно с помощью одной нуклеофекции. Раньше никому не удавалось сделать это в первичных клетках, а мы сделали это с клетками, выделенными из интактного органа. "
Генный нокаут и нокаут
Таким образом, в будущем исследователи смогут исключить отдельные гены и целые сигнальные пути и проанализировать их функции. Вырубив соответствующие гены, им уже удалось выяснить, играют ли роль в заражении ВИЧ четыре ранее спорных клеточных фактора или нет.
Вдобавок к этому они применили второй метод «нок-ин», при котором вставляются дополнительные или слегка модифицированные гены, такие как ген зеленого флуоресцентного белка .(ГФП). С помощью этого белка исследователи могут анализировать, как активность гена-мишени изменяется при определенных условиях, или маркировать определенные белки. «Все это вместе дает нам возможность впервые исследовать взаимодействие ВИЧ с покоящимися CD4+ T-клетками человека в физиологических условиях», — объясняет Адриан Руле, соавтор исследования. «Но мы также можем лучше исследовать эти клетки в их общей роли иммунных клеток помимо ВИЧ». В долгосрочной перспективе исследователи надеются, что лучшее понимание биологии этих клеток приведет к новым подходам к полной элиминации ВИЧ из тел пациентов, поскольку в мире все еще насчитывается около 37 миллионов человек, инфицированных этим вирусом.
