Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) является наиболее распространенным из всех генетических заболеваний сердца и основной причиной внезапной сердечной смерти. Он характеризуется аномальным утолщением сердечной мышцы, что со временем может привести к сердечной дисфункции и, в конечном итоге, к сердечной недостаточности.
В статье, опубликованной в Proceedings of the National Academy of Sciences ( PNAS ) и написанной в соавторстве с Бет Прюитт, профессором машиностроения Калифорнийского университета в Санта-Барбаре и директором Института биоинжиниринга в университетском городке, описаны результаты сложной долгосрочной сотрудничество, в котором участвовали исследователи из Стэнфордского университета, Вашингтонского университета и Университета Кентукки. Исследование привело к новому пониманию того, как генетические мутации на клеточном уровне вызывают HCM, и новым взглядам на то, как его предотвратить.
В своей статье авторы объясняют, что было идентифицировано более тысячи генетических мутаций , вызывающих ГКМП. Большинство из них содержится в генах, кодирующих саркомерные белки, структурные строительные блоки сердечной мышцы, ответственные за создание и регулирование сокращения и расслабления. Примерно треть мутаций находится в бета сердечном миозине, основном белке, который управляет сокращением сердечных клеток . Сокращение сердечной мышцы и любой другой мышцы нашего тела является результатом процесса, в котором моторный белок миозин «ходит» по цепочке молекул актина, процесс, известный как цикл перекрестных мостов. Во время этого процесса химическая энергия в форме АТФ преобразуется в механическую, что в конечном итоге приводит к сокращению сердца.
Перед сокращением головка одной цепи переплетенной двухцепочечной молекулы миозина заправлена против молекулы актина. Сокращение мышц начинается, когда молекула АТФ, известная как «энергетическая валюта» биологических систем, связывается с головкой миозина. Головка миозина и прикрепленный к ней АТФ затем отделяются от актина, инициируя гидролиз АТФ, который превращается в АДФ плюс фосфатную группу. Этот процесс высвобождает энергию, которая «переводит» белок миозина в высокоэнергетическое состояние и изменяет форму миозина, так что он готов ползти вдоль актина. В этот момент из миозина высвобождается фосфат, в результате чего миозин толкает актин и высвобождает фосфат, который заставляет миозин перейти к следующей цепи актина и сократить мышцу. Все это,
Поскольку HCM часто наблюдается у пациентов, имеющих мутации в бета сердечном миозиновом белке, было высказано предположение, что мутации HCM вызывают каскад событий, которые в конечном итоге проявляются в повреждении самого сердца. Это исследование проверило эту идею, сосредоточив внимание на единственной мутации, P710R, которая резко снизила скорость подвижности in vitro - скорость, с которой двигатель миозина движется по актину - в отличие от других мутаций MYH7, которые привели к увеличению скорости подвижности.
Главный исследовательский вопрос этого проекта состоял в том, чтобы узнать, как мутация, связанная с сердечными заболеваниями у пациентов, изменяет сердечную функцию на клеточном уровне.
Команда использовала технологию CRISPR для редактирования кардиомиоцитов плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных человеком (клеток, ответственных за сокращение сердца), путем вставки в них мутации P710R. Прюитт возглавляет банк стволовых клеток в UCSB, где поддерживаются и воспроизводятся «чистые» клеточные линии, не имеющие генетических аномалий, для университетских исследователей. Такие чистые, свободные от мутаций линии обеспечивают идеальный ориентир для сравнения с клетками, чтобы очень точно увидеть эффекты мутации P710R. Например, исследовательская группа сейчас проверяет эффекты различных мутаций, связанных с сердечными заболеваниями, на одном и том же генетическом фоне.
«У вас может быть десять человек с одинаковой генной мутацией в этом белке, и они могут иметь различную степень клинического значения, потому что остальная часть их генома отличается; это то, что делает нас индивидуальностями», - сказал Прюитт. «Эти строки позволяют нам изучить, что является результатом генетической мутации. Сравнивая эффект различных мутаций, мы можем начать дразнить, как эти изменения приводят к HCM. Это позволяет нам внимательно изучить, как и почему клетки адаптируются к мутации таким образом, и чтобы получить данные и связать их с толщиной стенки сердца и всем остальным, что происходит ниже по течению ».
Это исследование началось почти 15 лет назад, когда Прюитт еще работал в Стэнфорде, и привело к этой совместной работе. Теперь технология CRISPR позволяет исследователям создавать клетки, экспрессирующие определенные мутации, связанные с сердечными заболеваниями, а затем оценивать молекулярные и функциональные изменения, чтобы определить влияние отдельных мутаций на клетки, выявленных у пациентов с ГКМП. Эти исследования предоставят механистическое понимание того, как отдельные мутации на молекулярном уровне переводятся в ГКМП у пациентов.
В этом проекте, как только мутация была введена, клетки были проанализированы в сотрудничестве между лабораторией Прюитта (UCSB) и лабораторией Бернштейна (Стэнфордский университет) с использованием микроскопии тягового усилия, анализа, который позволяет одновременно наблюдать бьющуюся клетку и сила, которую он генерирует. Лаборатория Спудича (Стэнфорд) провела отдельные исследования одного и того же мутировавшего белка на молекулярном уровне с использованием оптической ловушки, в которой световое давление применяется для точного контроля местоположения и силы актиновой «гантели», удерживаемой между бусинами при ходьбе миозиновых голов. вдоль актина, чтобы измерить энергетический цикл миозина. Анализ показал, что мутация P710R снижает размер шага миозинового мотора (то есть длину каждого шага) и скорость, с которой миозин отделяется от актина.
В сотрудничестве с исследователем из Университета Кентукки Кеннетом Кэмпбеллом эти наблюдения были затем сопоставлены с вычислительной моделью того, как двигатели миозина взаимодействуют в клетке для создания силы. Результаты подтвердили ключевую роль в регуляции так называемого «супер-расслабленного состояния» миозина. Как объяснил Прюитт, «миозиновые головки проводят много времени в супер-расслабленном состоянии, имея в виду, когда они не связаны с актином. Любая мутация или лекарство, которые изменяют, как долго или насколько сильно миозиновые двигатели связаны с актином, изменит силу клеток. производство и изменение последующих сигнальных событий, которые управляют ремоделированием и ростом или гипертрофией ».
В этом исследовании было обнаружено, что мутация P710R дестабилизирует супер-релаксированное состояние. В результате большее количество миозиновых головок связано с актином в клетках, несущих мутацию, что объясняет увеличение силы, которое наблюдалось в этих клетках.
Для Прюитта ключевым выводом из работы, помимо важных научных открытий, является ценность устойчивого сотрудничества. «Шкалы, которые покрывает бумага, обычно не являются предметом исследования ни в одной лаборатории, ни даже в двух лабораториях», - сказала она. «Вот почему у статьи так много авторов, в том числе несколько студентов и постдоков, работающих со мной, Джеймсом Спудичем и Дэниелом Бернстайном.
«Это важно с научной точки зрения, но также удовлетворительно, поскольку такой уровень интеграции позволяет протестировать эту идею в нескольких масштабах. Было интересно работать в этих лабораториях и с этими навыками в таком обширном междисциплинарном сотрудничестве и видеть, что сила молекулярные измерения и вычисления, а также измерения на основе клеток, которые позволяют нам генетически спроектировать и выделить единственную мутацию », - сказал Прюитт. «Это действительно феноменально - напрямую проверить, как конкретная мутация вносит изменения, которые приводят к HCM».
В результате этого сотрудничества, добавил Прюитт, «мы можем понять, что происходит на клеточном уровне. Затем мы можем начать разрабатывать модели и определять лекарственные препараты следующего поколения. Вместо того, чтобы просто выявлять симптомы, мы можем изучить механизмы которые лежат в основе дисфункций, а затем устраняют их на клеточном уровне, прежде чем они перерастут в болезнь ».
